Đầu tiên, hãy điểm qua những gì chúng ta biết về các yêu cầu cho quy trình tủa ADN hoặc ARN bằng ethanol: 1. Muối để làm trung hòa điện tích trên bộ khung acid nucleic, giúp cho ADN trở nên kỵ nước hơn và bắt đầu kết lắng xuống. 2. Đặt trên đá để làm lạnh mẫu. Nhiệt độ thấp giúp việc tủa acid nucleic và khiến chúng hình thành một phức hệ lớn hơn, dễ dàng tạo thành kết tủa dưới lực quay của máy ly tâm. 3. Nồng độ đủ cao của acid nucleic buộc ADN phải lắng xuống (nếu nồng độ chưa đủ cao, hãy bổ sung thêm chất mang acid nucleic hoặc glycogen để hỗ trợ việc phục hồi mẫu). 4. Ly tâm để thu mẫu kết tủa. Dùng Isopropanol hay Ethanol: Độ tan của ADN ADN ít tan hơn trong isopropanol vì thế nó sẽ kết tủa nhanh hơn với nồng độ thấp hơn, nhưng nhược điểm là muối ở trong mẫu cũng bị kết tủa nhanh theo ADN. Còn với ethanol, ADN cần ở nồng độ cao hơn để kết tủa và muối không tạo kết tủa cùng với ADN, thậm chí cả ở nhiệt độ thấp. ADN bị kết tủa trong isopropanol 35% và nồng độ muối 0.5M. Nồng độ cuối cùng của ethanol sử dụng cần phải ở khoảng 75% với muối 0.5 M. Vì thế trong quy trình kết tủa thường dùng, isopropanol thêm vào gấp khoảng từ 0.7 -1 lần thể tích của mẫu và ethanol thêm vào gấp khoảng 2-2.5 lần thể tích mẫu. Lựa chọn dung môi : Thể tích của mẫu Nếu bạn muốn kết tủa một lượng nhỏ ADN và chỉ có thể cho vừa đủ lượng dung môi yêu cầu vào trong một ống mẫu, thì ethanol lạnh là sự lựa chọn tốt hơn. Bạn có thể làm lạnh ethanol (vài người sử dụng nitơ lỏng hoặc -80oC để tăng tốc độ tủa) và thu được nhiều ADN tủa hơn mà không bị nhiễm muối, điều mà sẽ xảy ra nếu isopropanol được làm lạnh. Sau đó bạn cần rửa tủa với 70% ethanol để loại muối. Isopropanol rất hữu ích khi bạn muốn tủa một lượng mẫu lớn (ví dụ như dịch rửa giải (eluate) mà bạn thu được khi sử dụng Kit Qiagen plasmid Maxi), vì cần ít dung môi hơn nên bạn có thể cho toàn bộ mẫu vào trong ống (15ml). Nhưng vì muối thường ít tan trong isopropanol hơn trong ethanol, nên chúng dễ có xu hướng kết tủa cùng với ADN. Vậy để giảm việc muối bị kết tủa, người ta tủa isopropanol tại nhiệt độ phòng với thời gian ủ ngắn nhất. Sau khi thu các tủa ADN và ARN từ việc tủa bằng isopropanol, bạn cần rửa nó với ethanol 70% lạnh để loại bỏ muối dư thừa và để thay đổi isopropanol bằng ethanol ở trong mẫu. Bạn có thể tủa mẫu bằng isopropanol ở nhiệt độ thấp nếu bạn chắc chắn rằng không có quá nhiều muối . Bởi vì ADN ít hòa tan hơn trong isopropanol, nên isopropanol cho phép tủa những mẫu kích thước lớn và nồng độ acid nucleic thấp hơn so với kết tủa bằng ethanol, đặc biệt nếu tăng thời gian ủ và ở nhiệt độ thấp. Nếu bạn làm điều đó, chỉ cần nhớ rằng cần rửa tủa vài lần với ethanol 70% sau khi tủa để giảm lượng muối trong mẫu. Khi nào sử dụng Ethanol hoặc Isopropanol Sử dụng ethanol nếu:
Sử dụng isopropanol nếu:
Bạn muốn sử dụng cái nào hơn? Dưới đây là phần chia sẻ kinh nghiệm của Bà Suzanne Kennedy- Giám đốc R&D tại phòng thí nghiệm Mo Bio, California; Tiến sĩ về Vi sinh và Miễn dịch tại đại học Virginia Commonwealth. “Tôi sử dụng ethanol nhiều hơn isopropanol trong hầu hết trường hợp, nhưng tôi sẽ dùng isopropanol nếu tôi cần mọi thứ được tiến hành vừa đủ trong một ống mẫu. Quy trình tôi hay chọn là 2 thể tích ethanol và để ở -20oC trong ít nhất một tiếng hoặc qua đêm để thu được kết quả tốt nhất. Tôi ly tâm mẫu ở tốc độ cao nhất trong 20 phút để đảm bảo mọi thứ lắng xuống đáy. Tôi luôn rửa mẫu với ethanol 70%, sau đó ly tâm trong 10-15 phút, và chú ý tới kết tủa khi đổ bỏ dịch nổi. Bạn cần đánh dấu hướng của ống tại đó có kết tủa và đừng mất dấu nó khi đổ bỏ ethanol! Nếu tôi sử dụng isopropanol, tôi tránh nhiệt độ thấp bởi vì muối dư thừa sẽ kết tủa cùng với mẫu. Nếu tôi muốn tăng hiệu quả kết tủa, tôi sẽ để nó tại nhiệt độ phòng lâu hơn chứ không làm lạnh mẫu. Khi ADN kết tủa, phần kết tủa đó thi thoảng khó nhìn hơn so với kết tủa bằng ethanol. Nó có thể trong suốt nhưng vẫn phải đảm bảo việc đánh dấu phía ống có kết tủa khi ly tâm. Tìm vị trí kết tủa trước khi đổ bỏ isopropanol và rửa ethanol 70%. Sau khi rửa với ethanol, kết tủa trở nên rõ ràng và có màu trắng. Phải luôn cẩn thận sao cho mẫu không bị trôi mất theo hướng của thành ống khi đổ bỏ dịch nổi. Để ống úp ngược xuống cho khô trong vài phút, sau đó để tự khô hoặc bằng máy làm khô chân không (5 phút là đủ) và hòa tan tủa với đệm. Cuối cùng, đối với các tủa ADN bị khô, làm ấm mẫu trong đệm ở 50-60oC sẽ giúp ADN tan nhanh hơn mà không bị phá hủy. Đối với ARN, việc làm ấm (trong nước) cũng có thể được sử dụng ở nhiệt độ khoảng 42oC. Việc làm khô quá mức ADN và ARN sẽ làm mất nhiều thời gian hơn để hòa tan trở lại vì vậy đảm bảo là không dùng máy làm khô chân không quá lâu”. |
