Hướng dẫn thí nghiệm xác định đồ thị michaelis menten năm 2024

Trương Thanh Tùng, Nguyễn Minh Tú, Bùi Thị Phương Hải (2020), Sổ tay thực tập hoá lý dược, Bộ môn KHCB & CS Dược

• TLTH HHC (6 bài) - Thực hành Hóa hữu cơ
• Problem 1 - innjnjnjnjnj
• 31-5-đề-Sở HOA12 23 201
• Bai tap Nhiet
• Hoa - san

Related documents

• How is Yogurt Made Step by Step Flow Cha
• DE THI THU CAC Truong VAO 6 - THAY BUI VAN VINH
• So sánh hàm lượng dưỡng chất
• Văn hóa ẩm thực miền bắc - văn hóa ẩm thực
• Bilirubin toàn phần là sản phẩm của quá trình thoái hóa hemoglobin sau đó đi qua gan
• Bài tập Động Hoá học - Tốc độ phản ứng Bậc phản ứng và năng lượng hoạt hoá

Preview text

Bài 5: Enzyme

• 1. Cách gọi tên và phân loại enzyme...............................................................
  • 1. Gọi tên....................................................................................................
  • 1. Phân loại.................................................................................................
• 1. Một số đặc tính của phân tử enzyme...........................................................
  • 1. Cấu tạo và cấu trúc enzyme...................................................................
  • 1. Trung tâm hoạt động và tính đặc hiệu cơ chất.......................................
  • 1. Các dạng cấu trúc của phân tử enzyme.................................................
• 1. Cấu trúc và chức năng của các coenzyme...................................................
• 1. Cơ chế xúc tác của enzyme.........................................................................
  • 1. Sự biến thiên năng lượng tự do (ΔG) và năng lượng hoạt hóa (Ea).........
  • 1. Cơ chế tác dụng của enzyme.................................................................
• 1. Động học enzyme......................................................................................
  • 1. Tốc độ phản ứng và đơn vị đo..............................................................
  • 1. Thuyết Michaelis-Menten......................................................................
• 1. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme....................................
  • 1. Nồng độ cơ chất [S]..............................................................................
  • 1. Nồng độ enzyme [E].............................................................................
  • 1. Nhiệt độ................................................................................................
  • 1. pH môi trường......................................................................................
  • 1. Chất hoạt hóa.......................................................................................
  • 1. Chất ức chế..........................................................................................

BÀI 5: ENZYME

Môi trường đặc biệt của các phản ứng sinh hóa trong cơ thể: + dung môi: nước (chiếm 2/3) + nhiệt độ: 37oC

• pH trung tính (~7)
• áp suất ôn hòa

Các phản ứng trong cơ thể phải diễn ra nhanh chóng, mạnh mẽ, được kiểm soát, điều hòa chặt chẽ phù hợp với nhu cầu cơ thể.

• Cần enzyme: xúc tác sinh học với đầy đủ tính chất của 1 xúc tác: o + không bị tiêu hao/ sinh thêm trong quá trình phản ứng o + chỉ làm tăng vpứ mà không tạo ra phản ứng o + không làm thay đổi hằng số cân bằng, chiều của phản ứng
• Ngoài ra, enzyme còn có 1 số tính chất của 1 phân tử sinh học:
• hầu hết là protein (một số là RNA)
• hiệu lực xúc tác lớn hơn nhiều lần so với xúc tác vô cơ thông thường
• có tính đặc hiệu cơ chất (substrate) và phản ứng
• hoạt động ở môi trường pH và nhiệt độ nhất định (dễ biến tính)
• kiểm soát và điều hòa chặt chẽ qua kiểm soát hoạt tính enzyme Enzyme đóng vai trò quan trọng trong các phản ứng trong cơ thể: thoái hóa các phân tử dinh dưỡng, tích lũy và chuyển dạng năng lượng, xúc tác tạo nên các phân tử phức tạp từ tiền chất của nó.

Giá trị thực tiễn lâm sàng của enzyme:

• Chẩn đoán và điều trị bệnh dựa trên đo hoạt độ enzyme trong huyết tương, hồng cầu, mô
• Nghiên cứu, chẩn đoán và điều trị các bệnh rối loạn di truyền do thiếu hụt, không có hoặc tăng cường hoạt động enzyme
• Nghiên cứu và ứng dụng điều chế thuốc hoạt động thông qua tương tác với enzyme
• Công cụ thực hành trong CN hóa sinh y học, CN thực phẩm và nông nghiệp
• Cách gọi tên, bản chất hóa học của enzyme

1. Cách gọi tên và phân loại enzyme...............................................................

1. Gọi tên....................................................................................................

• tên cơ chất + “ase”: urease (phân giải ure), protease (phân giải protein), nucleolase (phân giải nucleotide), lipase (phân giải lipid), ...
• tên tác dụng + “ase”: oxidase (pứ OXH), amino transferase (pứ trao đổi amino acid), decarboxylase (khử CO 2 ), ...
• tên cơ chất + tác dụng + “ase”: lactate dehydrogenase (khử hydro trong lactate), tyrosin decarboxylase (khử CO 2 ), ...
• tên thường gọi (không theo quy tắc): trypsin, pepsin, chymotrypsin, rubisco, ...

Hydrolase

(Enzyme thủy phân)

• xúc tác cho phản ứng cắt đứt liên kết hóa học = thủy phân
• có sự tham gia của H 2 O: AB + H 2 O  AH
• BOH

Esterase + thủy phân liên kết ester Glucosidase

• thủy phân liên kết glycosidic Protease
  • thủy phân liên kết peptide

Phosphatase

• thủy phân liên kết ester phosphate
• tách gốc -PO3- khỏi cơ chất

Phospholipase

• thủy phân liên kết ester phosphate trong phospholipid Amidase
• thủy phân liên kết amide

Deaminase

• thủy phân liên kết C-N
• tách nhóm amino (- NH 2 ) ra khỏi cơ chất

Nuclease

• thủy phân liên kết ester phosphate trong DNA/ RNA

Lyase

(Enzyme phân cắt)

• các enzyme tách nhóm
• xúc tác cho phản ứng chuyển 1 nhóm hóa học khỏi cơ chất
• không có sự tham gia của H 2 O: AB  A + B

Decarboxylase + tách CO 2 từ cơ chất

Aldolase + tách 1 ptu aldehyde từ cơ chất Lyase

• tách đôi 1 ptu mà không có H 2 O Hydratase
• gắn 1 ptu H 2 O vào cơ chất Dehydratase
• tách 1 ptu H 2 O khỏi cơ chất

Synthase

• gắn 2 ptu mà không có ATP (không cần năng lượng)

Isomerase

(Enzyme đồng phân)

• xúc tác cho phản ứng biến đổi giữa các đồng phân của chất: ABC  ACB

Racemase

• chuyển dạng đồng phân giữa dãy D và L (optical isomer)
• chuyển dạng giữa các ptu có 1 chiral carbon

Epimerase

• chuyển dạng đồng phân các ptu có nhiều chiral carbons Isomerase
• chuyển dạng giữa nhóm ketone và aldehyde

Mutase + chuyển nhóm hóa học giữa các ngtu trong 1 ptu

Ligase

/

synthetase

(Enzyme tổng hợp)

• xúc tác cho phản ứng gắn 2 ptu thành 1 ptu lớn hơn
• có ATP/ GTP: A + B  AB (ATP  ADP + Pi)

Synthetase + gắn 2 ptu với nhau có mặt ATP Carboxylase + gắn CO 2 vào cơ chất

Ligase + gắn 2 đoạn nucleotide với nhau

• Lưu ý: Phân biệt chức năng của các enzyme cùng loại nhưng khác lớp:
• Thành phần cấu tạo, cấu trúc, trung tâm hoạt động của enzyme

2. Một số đặc tính của phân tử enzyme...........................................................

2. Cấu tạo và cấu trúc enzyme...................................................................

• Đơn vị: Dalton (Da/ đvC/ u): đơn vị đo khối lượng nguyên tử 1 Da = 1/12 C 12 Da
• Cấu tạo: protein, thường từ 12 – hàng triệu Da
• Thành phần:

5

enzyme

enzyme thuần

chỉ có amino acid không có coenzyme

amylase, protease

enzyme tạp (holoenzyme)

amino acid (apoenzyme)

chất cộng tác (cofactor)

coenzyme ion kim loại (Fe2+, Cu2+,...)

Isomerase

Isomerase

chuyển loại

nhóm chức

Mutase

chuyển vị trí

nhóm chức

Synthetase

Synthetase

tổng hợp cần

có ATP

Synthase

tổng hợp

không cần

ATP

Transferase

Phosphorylase

chuyển nhóm

Pi tự do vào

phân tử

Kinase

chuyển nhóm

Pi từ chất hữu

cơ vào phân

tử

• active site có cấu trúc chỉ khớp được với cơ chất của nó
• active site có tính mềm dẻo và linh hoạt
• có thể biến đổi cấu trúc không gian để phù hợp với cơ chất
• giải thích được tính đặc hiệu tuyệt đối
• không giải thích được tính đặc hiệu tương đối
• giải thích được tính đặc hiệu tương đối
• được đa số các tác giả hiện nay chấp nhận
• Trung tâm dị lập thể enzyme, ý nghĩa trong chuyển hóa chất
• Isoenzyme, phức hợp đa enzyme, cho ví dụ

2. Các dạng cấu trúc của phân tử enzyme.................................................

1. Bản chất hóa học các coenzyme, ví dụ một số coenzyme và vai trò của chúng

3. Cấu trúc và chức năng của các coenzyme...................................................

• Chức năng:
  • tham gia cùng enzyme trong quá trình xúc tác do ái lực giữa enzyme
  • coenzyme giống ái lực giữa enzyme – cơ chất
  • gắn đồng hóa trị với enzyme, tạo ra trung tâm hoạt động cho enzyme trong xúc tác pứ

Cấu trúc enzyme

enzyme đơn chuỗi & đa chuỗi

do 1 hoặc 1 vài chuỗi polypeptide tạo nên

monomer: do 1 polypeptide

oligomer/ polymer: do vài polypeptide

enzyme dị lập thể (allosteric enzyme)

chứa vị trí dị lập thể để điều chỉnh HĐ xúc tác của enzyme

hoạt hóa allosteric: DLT dương + activator (a)

a: chất đứng trước cơ chất trong chuỗi pứ

ức chế allosteric: DLT âm + inhibitor (i)

i: chất đứng sau/ sp cuối trong chuỗi pứ

các dạng phân tử của enzyme (isoenzyme/ isozyme)

các enzyme cùng xúc tác 1 phản ứng nhưng khác nhau về bản chất

tính chất hóa học và vật lý khác nhau

xuất hiện ở TB/ mô khác nhau

lactate dehydrogenase (LDH): 5 đồng phân: LDH 1 ---> LDH 5

creatine kinase (CK): 3 đồng phân CK- MM, CK-MB, CK- BB

hằng số Michaelis (Km) và Vmax khác nhau

tiền enzyme (proenzyme/ zymogen)

các enzyme chưa có hoạt tính

hoạt hóa bằng cách thủy phân đoạn polypeptide che lấp active site

"-ogen": pepsinogen, trypsinogen

"pro-": prothrombin

phức hợp đa enzyme (enzyme complex)

gồm nhiều enzyme khác nhau nhưng có liên quan tới nhau

sự cộng tác giữa các enzyme làm tăng hiệu lực & hiệu quả xúc tác

biến tính & bất hoạt nếu tách từng enzyme

PH pyruvate dehydrogenase: gồm pyruvate dehydrogenase, dihydrolipoyl transacetylase, dihydrolipoyl dehydrogenase

1. Cơ chế hoạt động xúc tác phản ứng của enzyme

4. Cơ chế xúc tác của enzyme.........................................................................

4. Sự biến thiên năng lượng tự do (ΔG) và năng lượng hoạt hóa (Ea).........

(Ea)

• Năng lượng tự do (G): năng lượng có thể tạo ra công có ích
• phản ứng xảy ra khi ΔG < 0
• Trong phản ứng hóa học thông thường, ngay cả khi ΔG < 0, phản ứng vẫn chưa thể xảy ra do sức ỳ hóa học:  entropy (S): phản ứng xảy ra theo chiều giảm sự hỗn loạn của các ptu trong hệ  môi trường: lớp áo nước gây cản trở  mất hoạt tính của cơ chất  cấu trúc: hình thể không gian cồng kềnh của cơ chất  chức năng: sự sắp xếp chưa định hướng của các nhóm chức trong ptu enzyme
• Phản ứng xảy ra khi năng lượng tự do ΔG < 0 và năng lượng hoạt hóa

Ea > sức ỳ hóa học

• Năng lượng hoạt hóa (Ea): năng lượng cần thiết để nâng 1 mol cơ chất lên trạng thái chuyển tiếp (transition state) ở đỉnh hàng rào năng lượng (tại nhiệt độ nhất định) để phản ứng có thể xảy ra

4. Cơ chế tác dụng của enzyme.................................................................

• Enzyme làm giảm Ea của phản ứng để cơ chất  trạng thái chuyển tiếp  sản phẩm 1 cách dễ dàng hơn
• Enzyme thực hiện điều đó bằng cách tạo ra phức hợp enzyme-cơ chất – trạng thái chuyển tiếp có mức năng lượng hoạt hóa thấp hơn nhiều so với ban đầu: E + S  ES  E + P (a) (b) Với: +) E = enzyme; S = substrate; ES = enzyme-substrate complex; P = product

+) (a) phản ứng liên phân tử (b) phản ứng nội phân tử

• Các cách thức làm tăng Vpứ của enzyme:
• xúc tác acid-base nói chung: các chất cho và nhận proton được định vị đúng vị trí
• xúc tác đồng hóa trị: trạng thái chuyển tiếp không ổn định
• xúc tác ion kim loại: cho và nhận e
• tác động điện: “căng giãn orbital” của Koshland, phá vỡ nhân thơm
• Cơ chế tác dụng của enzyme: o Các tương tác yếu giữa cơ chất và enzyme tại active site (hydro, ionic, hydrophobic) giải phóng ΔG o Hình thành phức hợp ES thông qua trạng thái chuyển tiếp E- S1* o ΔG tiếp tục hoạt hóa phức hợp ES lên trạng thái chuyển tiếp E- S2*, E-S3*... o Với Ea thấp, phức hợp dễ dàng được hoạt hóa để tạo ra sphẩm và enzyme tự do
• Đơn vị quốc tế đo hoạt độ enzyme

5. Động học enzyme......................................................................................

5. Tốc độ phản ứng và đơn vị đo..............................................................

• Hoạt độ enzyme: lượng enzyme làm biến đổi 1 μmol cơ chất thành sản phẩm trong 1 phút ở 25oC và các điều kiện chuẩn khác o + đơn vị: IU (international units)
• Tốc độ phản ứng: lượng cơ chất biến đổi dưới tác dụng của enzyme trong 1 phút ở 25oC và các điều kiện chuẩn khác
• tốc độ phản ứng ban đầu (Vinitial):  Là tốc độ pứ enzyme ở khoảng thời gian đầu của phản ứng  Khi tốc độ chưa bị ảnh hưởng bởi sự thay đổi của T, pH, [C], ...  Tăng lên 1 cách tuyến tính ban đầu (proportional) sau đó k tăng tuyến tính nữa  Chỉ tại Vintial, hoạt độ enzyme mới được đo chính xác (~5 phút)
• tốc độ phản ứng tối đa (Vmax):  Khi các phân tử enzyme đều bão hòa cơ chất, tốc độ phản ứng đạt mức tối đa  Enzyme là nhân tố giới hạn (limiting factor)
• Phương trình và đồ thị Michaelis-Menten, ý nghĩa Km

5. Thuyết Michaelis-Menten......................................................................

E-S

ES ES

E-S1 E-S

đủ với cơ chất

1. Phương trình và đồ thị Lineweaver-Burk, ý nghĩa đồ thị
2. Phương trình Lineweaver – Burk:
3. So sánh giữa phương trình và đồ thị Michaelis – Menten và Lineweaver
   • Burk:

Michaelis-Menten Lineweaver-Burk Đồ thị hyperbol Đồ thị tuyến tính Khó xác định Vmax, Km Có thể xác định Vmax, Km

Chỉ mang tính chuẩn xác trên lý thuyết

Áp dụng tốt trên thực nghiệm để xác định:

• pH – nhiệt độ tối ưu
• chất ức chế cạnh tranh/ không cạnh tranh đối với enzyme

6. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme....................................

Trong thực nghiệm lâm sàng, người ta thường sử dụng hoạt độ enzyme thay vì nồng độ enzyme để nghiên cứu và chẩn đoán do lượng enzyme trong huyết thanh thường rất ít. Trong nghiên cứu, tốc độ phản ứng của enzyme thường được đánh giá qua các yếu tố sau:

6. Nồng độ cơ chất [S]..............................................................................

6. Nồng độ enzyme [E].............................................................................

• nhiệt độ

6. pH môi trường......................................................................................

6. Chất hoạt hóa.......................................................................................

(activator)

6. Chất ức chế..........................................................................................

(inhibitor)

1. Nồng độ cơ chất [S]
2. Khi nồng độ enzyme [E] giữ nguyên, nếu nồng độ cơ chất [S] tăng thì tốc độ phản ứng tăng cho đến khi enzyme bão hòa
3. Thể hiện qua phương trình và đồ thị Michaelis – Menten

Đồ thị Lineweaver-Burk

( )

1. Nồng độ enzyme [E]
2. Khi nồng độ cơ chất [S] giữ nguyên, nếu nồng độ enzyme [E] tăng thì tốc độ phản ứng tăng
3. Giá trị Km không đổi khi thay đổi nồng độ enzyme [E]
4. Ảnh hưởng của nhiệt độ và pH đến hoạt động của enzyme, ví dụ pH hoạt động tối ưu của 1 số enzyme

6. Nhiệt độ................................................................................................

• Khi tăng nhiệt độ dần lên mức nhiệt độ tối ưu của enzyme, tốc độ phản ứng tăng và thường tăng gấp 2 lần mỗi khi tăng 10oC.  Hệ số nhiệt độ (temperature coefficient) Q 10 = 2
• Khi tăng nhiệt độ vượt quá mức nhiệt độ tối ưu, enzyme bắt đầu biến tính và mất dần khả năng xúc tác của nó  Trong lâm sàng, các mẫu huyết tương được đông lạnh trước khi nghiên cứu
• Một số vi khuẩn sống ở môi trường có điều kiện khắc nghiệt (suối nước nóng, đáy biển nóng) có chứa enzyme rất bền với nhiệt (75-80oC): Taq DNA polymerase, Tli DNA polymerase, Pfu DNA polymerase, Tth DNA polymerase, Tma DNA polymerase, ...  Được sử dụng cho phản ứng chuỗi polymerase (polymerase chain reaction – PCR)
• pH môi trường
• Thay đổi pH có thể gây biến tính enzyme, do các ion mang điện tích trong dung dịch làm ảnh hưởng đến trạng thái ion hóa của enzyme  Biến đổi cấu trúc/ thay đổi điện tích trên các gốc amino acid ở active site

Tăng va chạm hiệu quả và các phản ứng được cung cấp đủ năng lượng để hoạt hóa

Phản ứng đạt tốc độ tối đa

Enzyme bị biến tính và bất hoạt làm giảm tốc độ phản ứng

1. Ảnh hưởng của các chất ức chế cạnh tranh đến hoạt động của enzyme, đặc điểm loại ức chế này

6.6. Ức chế thuận nghịch

Ức chế cạnh tranh Chất ức chế Chất có cấu trúc tương tự như cơ chất của enzyme Vị trí tác động Trung tâm hoạt động (active site)

Cơ chế

• phức hợp EI hình thành thay vì ES
• không có sự xúc tác xảy ra

Ảnh hưởng khi tăng [S] Cơ chất S cạnh tranh ngược lại với chất ức chế I

Phương trình & đồ thị

• Michaelis-Menten: V = Vmax
• Lineweaver-Burk:
• Vmax không đổi nhưng Km tăng do [S] tăng

Ví dụ lâm sàng

• điều trị ngộ độc methanol:  Alcohol dehydrogenase chuyển methanol  formaldehyde  Ethanol cạnh tranh với methanol  acetaldehyde => truyền chậm ethanol trong tĩnh mạch
• điều trị bệnh gout:  Xanthine oxidase chuyển xanthine  uric acid (urate tích tụ gây bệnh)  Thuốc Allopurinol cạnh tranh với xanthine  ngăn qtrinh tạo urate

( ) ( )

1. Ảnh hưởng của các chất ức chế không cạnh tranh đến hoạt động của enzyme, đặc điểm loại ức chế này

Ức chế không cạnh tranh hỗn hợp Ức chế không cạnh tranh

Chất ức chế

Chất gắn vào vị trí dị lập thể của cả enzyme tự do và phức hợp ES

Chất gắn vào phức hợp ES để ngăn xúc tác xảy ra Vị trí tác động Vị trí dị lập thể (allosteric site) Vị trí dị lập thể (allosteric site)